Ферментационные процессы – это один из самых запущенных процессов современной науки. Это связано с рядом причин. При разложении клетки на компоненты, не всегда возможно понять, как эти компоненты организованы внутри и каких образом они работают и взаимодействуют друг с другом (рис. 1). Клетки должны отзываться на внешнюю среду в режиме «реального времени». При этом, те аналитические методы, которые используются для контроля состояния клетки, дают не статистический результат.
Рис. 1. Строение клетки
Изучая любое биотехнологическое производство, можно наблюдать проблему оптимизации. Производство состоит из верхнего эшелона научных работников, которые прекрасно понимают процессы, происходящие на производстве, и тех, кто ими управляет, а также эшелона работников среднего уровня, которые должны выполнять набор определенных процедур по измерениям. Их компетенция на этом заканчивается.
С одной стороны, данное утверждение является верным, так как оно строится на четком распределении обязанностей. С другой стороны, в таком подходе тяжело соединить, «нижний уровень» получения данных, и «верхний уровень», когда мы попытаемся оптимизировать процесс, или, более того, активно воздействовать на него в режиме «реального времени». Электрооптика нашла золотую середину, потому что те параметры, которые мы анализируем, достаточно просты для персонала среднего уровня, и, в тоже время, если мы делаем очень точный анализ, то можем выявить целый ряд дополнительных параметров, которые будут доступны только высшему эшелону технологов, работающих с этим прибором.
В эпоху объектного анализа. Мы имеем некую совокупность параметров какого-либо объекта, например, бактериальные клетки, и некие события, которые происходят, когда клетка живет. В клетке зарыта очень простая идеология: она должна создать определенное количество генераций: питаться – делиться, питаться – делиться и тд. Данный процесс должен продолжаться бесконечно. Процессы периодического и непрерывного культивирования сопряжены с тем, что, либо мы должны первоначально создать условия для благоприятного развития клеток, после чего будем иметь несколько генераций клеток (6-8 генераций), либо мы должны иметь какой-то инструмент, который позволит вначале создать минимум возможностей для развития клетки (в том числе питательных возможностей), после чего пытаться активно отслеживать данную ситуацию.
Так как у клетки вся информация заложена на поведенческом уровне, первое, что происходит при попадании в свежую питательную среду – насыщение. При этом клетка не понимает, кончится ли питательная среда в определенный момент, или она бесконечна. Именно поэтому клетка начинает активно потреблять субстраты. Данный процесс с одной стороны положителен, а с другой стороны сопряжен возможностью ожирения клетки.
Когда мы смотрим на процесс, мы знаем, что традиционная фаза развития клеток — это закисление питательной среды. Почему оно происходит? При избытке субстрата клетка начинает утилизировать этот субстрат. Для этого у нее есть несколько механизмов. Например, цикл гликолиза, при котором клетка разрушает глюкозу, как основной энергетический субстрат, и направляет его поток в цикл Кребса для того, чтобы формировались все компоненты, необходимые для создания новой копии данной клетки (рис. 2).
Рис. 2. Цикл Кребса
Как оказалось, в процессе есть несколько бутылочных горлышек, и главное горлышко располагается на границе соприкосновения процесса гликолиза и цикла Кребса. Это тонкое место располагается там, где синтезируется пируват. Избыток пирувата вызывает за собой последовательную цепь негативных реакций.
С одной стороны клетка, создав промежуточный продукт, клетка решает проблему запаса химического соединения. Это благотворно может подействовать, когда гликолиз закончится. То есть, когда разрушать глюкозу, которая поступает в клетку уже не придется, потому что ее нет в окружающей среде.
С другой стороны, избыток пирувата вызывает к жизни несколько дополнительных метаболических путей, которыми клетка пытается утилизировать избыток этого компонента. Продуктом утилизации является появление слабых органических кислот (рис. 3).
Формула: C3H6O3
Молярная масса: 90,08 г/моль
Плотность: 1,225 г/см³
Температура кипения: 122 °C
Хим. формула: CH3CH(OH)COOH
Рац. формула: C3H6O3
Фумаровая кислота
Формула: C4H4O4
Молярная масса: 116.07 г/моль
Плотность: 1.635 г/см³
Температура плавления: 287 °C
Хим. формула: HOOC-CH=CH-COOH
Рац. формула: C3H6O3
Рис. 3. Органические кислоты
Появление такого компонента для клетки является негативным, потому что уксусная кислота, ингибитор, начинает подавлять процессы. Избавиться от уксусной кислоты клетка не может, так как в диапазоне тех pH, в которых находится в этот момент цитоплазма клетки, она не может воспользоваться активным транспортом, ей доступен только пассивный (рис. 4).
Рис. 4. Виды транспорта
Пассивный транспорт при этом будет очень слабым, а активный транспорт не может быть сильным из-за того, что ионы в данной ситуации, например, уксусной кислоты, не могут подойти к внутренней стенке мембраны. Соответственно, не могут воспользоваться теми каналами, которыми клетка выбрасывает эти ионы наружу. pH внутри клетки начинает падать, клетка все больше отравляется из-за кислого pH. Только в тот момент, когда ионы уксусной кислоты объединятся с протонами. Возникает нейтральная уксусная кислота, только в этот момент активный транспорт может стартовать. До этого времени мы ничего не видим, так как обмена с внешней средой нет. Клетка является капсулированным объектом.
Электрооптика позволяет ответить на вопрос: каким образом и с какой скоростью происходит процесс. Это даёт возможность на старте использовать низкие концентрации энергетических субстратов. То есть, так как мы можем с помощью электрооптики определить суммарный внутренний ионный состав, у нас есть ключ к тому, что в данный момент нужно клетке.
Мы можем дать слабый уровень энергетического субстрата. В этот момент клетка будет работать на пределе той пропускной способности гликолитического цикла, которая необходима для того, чтобы все, что появилось в гликолизе, ушло в цикл Кребса.
Соответственно, если у нас нет инструмента, который позволяет анализировать суммарную ионную концентрацию, мы не можем предугадать, какая исходнуая концентрация энергетического субстрата должна быть и оптимизировать этот процесс. Один из принципиальных достоинств электрооптики - мы понимаем, какой процесс происходит в клетке с задержкой 5-8 минут. Этого вполне достаточно, чтобы сформировать разумную стратегию управления этим процессом.
Необходимо также сказать, что биотехнологи интуитивно знают о существовании такой проблемы и идут на различные ухищрения. Например, мы можем создать низкую концентрацию глюкозы и определённую концентрацию сахарозы. Либо мы можем создать концентрацию глюкозы и глицерола (рис. 5). Это приводит к тому, что клетка в начале выбирает наиболее доступный энергетический субстрат. Затем с определенного момента у нее включается механизм разрушения сахарозы или глицерола на глюкозу, таким образом клетка создает «второе дыхание». Это один из параметров, который позволяет мерить электрооптика.
Рис. 5. Глицерол (глицерин):
Формула: C3H8O3
Молярная масса: 92,09 г/моль
Плотность: 1,26 г/см³
Температура кипения: 290 °C
Рац. формула: HOCH2-CH(OH)-CH2OH
Видео 1. Электрооптика - что это такое? Клетка: строение, деление, клеточный транспорт
Поиск
