Поиск
Поиск
Достоинства EloTrace:
Определение метаболической активности клеток в режиме реального времени позволяет успешно решать вопросы валидации, оптимизации и масштабирования ферментационных процессов. На временном профиле метаболической активности клеток в течение процесса культивирования можно выделить зоны плавного изменения параметров и точки их резкого изменения, которые называются метаболическими ключами. Такие точки соответствуют смене типа процесса биосинтеза, переходу пассивный/активный транспорт через мембрану, резкой смене внутриклеточного pH, морфологическим изменениям клеточной структуры, например, образованию телец включения, спорообразованию или изменению формы клеток.
Контроль метаболической активности клеток осуществляется в основном по изменению концентрации метаболитов внутри клеток или в культуральной среде. Причем первый метод является более предпочтительным, так как он исключает опосредование измеряемых параметров средой. Прямое измерение концентрации метаболитов внутри клеток без их разрушения путем введением маркеров или их спектрометрическими измерениями при рутинных измерениях достаточно трудоемко, и предсказание появления точек возникновения метаболических ключей затруднено. Среди косвенных методов рутинного и быстрого измерения метаболической активности клеток можно выделить электрооптический метод определения общей интенсивности внутриклеточных ионных потоков, основанный на определении удельной электропроводности цитоплазмы.
На формирование величины удельной электропроводности цитоплазмы влияет ряд факторов - интегральный пул возможных ионов, концентрация ионов, их подвижность и степень диссоциации соединения, образующего эти ионы в цитоплазме. Последний параметр прямо зависит от внутриклеточного pH. После избирательной селекции число участников ионного пула, и их вклад в суммарную электропроводность цитоплазмы оказывается ограниченным либо в силу низкой концентрации, либо в силу низкой подвижности. Как правило, значимыми ионами остаются протоны, слабые органические кислоты как вторичные метаболиты, ионы K+, Mg++, NADH и специфические низкомолекулярные соединения, характерные для данного типа метаболизма.
Дополнительно часть ионных потоков формируется за счет образования аплеротических путей утилизации промежуточных соединении при разбалансировке отдельных стадий метаболизма и образования избыточной концентрации промежуточного соединения. Как пример можно привести образование ацетата из избытка пирувата при аэробном типе метаболизма.
Применительно к метаболической активности клеток Clostridium в бутанольно-ацетоновом типе метаболической активности можно выделить ряд его специфических деталей, которые показаны на рисунках ниже:
Низкое значение pH на начальной стадии культивирования Clostridium соответствует слабой степени диссоциации ионов в цитоплазме и облегченному активному транспорту. Недиссоциированные соединения беспрепятственно подходят к внутренней стороне мембраны и выходят в среду культивирования. Увеличение внутриклеточного pH будет способствовать возрастанию степени ионизации оставшихся соединений и увеличению удельной электропроводности цитоплазмы.
Появление циклических участков изменения обычно указывает на процессы авторегуляции при утилизации исходных субстратов. Активный биосинтез бутанола способствует появлению протонов и увеличению величины удельной электропроводности цитоплазмы. Наличие в схеме метаболизма промежуточных диссоциируемых низкомолекулярных соединений также приводит к увеличению удельной электропроводности цитоплазмы.
Резкий спад величины удельной электропроводности цитоплазмы при завершении бутанольной фазы метаболизма может быть связан со связыванием в гранулах масляной кислоты части ионов, наличием в цитоплазме слабо диссоциированной восстановленной формы NADH и множеством других факторов.
Последующее возрастание величины удельной электропроводности цитоплазмы обусловлено активизацией стадии синтеза ацетата и ацетона. Связь величины удельной электропроводности цитоплазмы с биосинтезом ацетата как по основным, так и по аплеротическим путям достаточно хорошо исследована на примерах аэробного культивирования бактерий E.Coli. Спад на завершающей стадии процесса культивирования Clostridium связан c активным транспортом ацетата и ацетона во внешнюю среду.
Идентификация фаз активного транспорта через клеточную мембрану на всех стадиях клеточного метаболизма фиксируется при электрооптическом анализе клеток по изменению проводимости мембраны. Дополнительная информация о накоплении токсичных метаболитов и морфологических перестройках в клетках может быть получена при анализе профиля изменения среднего размера клеток.
Несмотря на приведенный выше конспективный анализ кинетики процесса культивирования, видно, насколько большой объем оперативной информации может быть получен в процессе рутинного, электрооптического, автоматического мониторинга процесса культивирования. Каждая фаза клеточного метаболизма и активного транспорта через мембрану характеризуется строго фиксированными величинами удельной электропроводности цитоплазмы, проводимости мембраны, привязанными к моментам времени культивирования. Наличие зон перегиба параметров с появлением на профилях измерения параметров локальных максимумов и минимумов, как правило, идентифицирует появление одного из метаболических ключей: перехода типа метаболизма, перехода от активного транспорта к пассивному и обратного процесса. Образование гранул включения, начала спорообразования также имеет жесткую привязку к величине удельной электропроводности цитоплазмы.
Из приведенных данных следуют три основные области применения электрооптического анализа клеток, основанные на фиксации профилей трех параметров - величины удельной электропроводности цитоплазмы, мембраны и клеточной стенки.
